Cómo utilizar una columna de fase inversa por Primera Vez

cromatografía de fase inversa , o RPC , se utiliza para purificar las proteínas y otras moléculas que forman interacciones hidrofóbicas con la matriz de la columna , también llamada fase sólida. La columna se lava y se equilibra con un disolvente acuoso que facilita la unión de la molécula de la muestra hidrófobo con la matriz de la columna hidrófoba . La molécula de muestra puede eluirse forma la columna mediante el aumento de la hidrofobicidad del disolvente acuosa por adición gradual de disolvente orgánico en el disolvente acuoso . Para purificar con éxito su proteína , es esencial que se equilibre , lavar y eluir la columna correctamente. Instrucciones Matemáticas 1

Preparar su columna de fase inversa equilibrando con 10 volúmenes de columna de solución de lavado. Este es normalmente conocido como tampón o disolvente A. Tampón A es un disolvente a base de agua con 0,1 por ciento de ácido . El mismo tampón A se utiliza , junto con la orgánica tampón B , para eluir la muestra . El ácido fórmico , ácido trifluoroacético o ácido acético se utilizan normalmente para hacer búfer A. Haga solución al 0,1 por ciento por la adición de 1 ml de ácido en 1 litro de agua.
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Aplique su primera muestra en la columna. Preparar la muestra mediante la dilución en tampón A.
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Lavar la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de 100 por ciento A. Esto ayuda a lavar las moléculas adicionales en la muestra que no se unen a la columna, dejando sólo su bind molécula muestra detrás .
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eluir la muestra aumentando gradualmente la hidrofobicidad de la solución de elución. Esto se logra mediante la mezcla gradualmente tampón A y tampón B juntos. Comienza con tampón de 99 por ciento A y tampón B 1 por ciento y aumentar gradualmente la cantidad de tampón B y disminuir la cantidad de tampón A. Al final del gradiente , la solución de elución es tampón de 0 por ciento y un 100 por ciento tampón B.
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Recoge todo el disolvente que sale de la columna después de comenzar la elución. Esto se hace generalmente recogiendo unas fracciones mililitro en pequeños tubos. Esto asegura que no perderá su muestra , si usted no sabe en qué momento se eluye concentración de tampón punto B de la matriz de la columna . La mayoría de las máquinas cromatográficos están equipadas con un espectrómetro que analiza cada fracción de proteína . Deseche todas las fracciones que no contienen proteínas y guardar sólo las fracciones que son positivas para la proteína .
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Lávese la columna con 10 volúmenes de tampón de 100 por ciento de A después de haber ejecutado la totalidad del gradiente de elución. Después de esto, su columna está lista para la segunda muestra o para ser regenerado y preparado para su almacenamiento.