GST Eliminación Tag

Clonar su proteína con la glutatión S - transferasa sistema de fusión de genes (GST ) le permite purificar fácilmente su proteína utilizando una cromatografía de glutatión acoplado . Sin embargo, para otros experimentos , es posible que desee quitar la etiqueta grande GST de su proteína. Esto se puede lograr con un tratamiento simple de la proteasa que escinde la N - o C- terminal de la etiqueta GST de la proteína . El procedimiento puede variar en función del sistema de fusión de genes GST que usaste. Siempre siga las instrucciones que aparecen en el manual de GST. Instrucciones Matemáticas 1

Disolver 500 unidades de trombina en 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato fría. Agitar suavemente para que la proteasa se ​​disuelva. Esto hace que una solución de trombina de 1 U /microlitro . Si está utilizando otra proteasa , siga las instrucciones especificadas en el manual de GST
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Mix 80 unidades - . 80 microlitros - de la trombina en 920 microlitros de tampón PBS por cada mililitro de glutatión Sepharose utiliza en su la columna . Por ejemplo , si ha utilizado 2 mililitros de glutatión sepharose para hacer su columna, utilice 160 microlitros de trombina y 1840 microlitros de PBS. Si está utilizando otra proteasa , siga las instrucciones especificadas en el manual al hacer su mezcla de proteasa.
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Aplique la mezcla de trombina en la columna de glutatión de haber aplicado previamente el GST proteína marcada . La etiqueta GST se une al glutatión, la celebración de su proteína dentro de la columna. También puede quitar la etiqueta GST después de haber eluido su proteína de la columna mediante la mezcla de su proteína con la mezcla thrmobin en un tubo .
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Selle la columna y se incuba a temperatura ambiente durante 2 a 16 horas . Algunas proteasas pueden incubarse en 4 grados Celsius. Siga las instrucciones específicas en el manual de GST.
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Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón PBS. Recoger el flujo a través en un par de tubos separados y analizarlos . El flujo a través de su proteína contiene , así como la trombina , mientras que la etiqueta de GST permanece unida a la columna . Si se quita la etiqueta GST en un tubo, su proteína libre se mezclará con la etiqueta GST y la trombina.