Cómo diseñar cebadores para la PCR RT

reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) hace copias de ADN de plantillas de ARN . Esto es lo opuesto al orden natural de copiar moldes de ADN para hacer transcripciones de ARN . Se utiliza para hacer una copia de ADN expresadas " exón " secuencias de ARN - sin los que intervienen no transcritas - " intrones ". Hacer cebadores para la RT PCR utiliza el hecho de que los intrones están excluidos de la secuencia. Instrucciones Matemáticas 1

Utilice secuencias de ADN reales para su comparación con el ADNc , que se logra más fácilmente mediante un ordenador . Es necesario localizar las posiciones de intrones .
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Diseñe sus iniciadores a partir del ADNc a partir de secuencias de exón que se encuentran a ambos lados de un intrón en su ADN . En la plantilla de ADNc , el cebador sería una secuencia de exón continua mientras que en el ADN del cebador se dividiría por un intrón . Usted puede confirmar la amplificación real de la secuencia de ADNc más tarde , como el cebador no hibridar con ADN contaminante porque el intrón interrumpirá la cartilla.
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Siga los parámetros normales de diseño , además de la colocación de imprimación intrón . En otras palabras , se quiere evitar una secuencia que va a recocer a sí misma (forma de horquilla bucles ) o que se unirán con el otro cebador ( dímeros forma de cebadores ) .
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Diseño cebadores de manera que sean 18-30 nucleótidos de largo , con una temperatura de fusión entre 45 a 65 grados Celsius. Evitar largas repeticiones de bases y elegir una secuencia con un contenido de GC de 40-60 por ciento . Asegúrese de que su ' ( tres prima ) extremo 3 no es demasiado pesado en Gs y Cs para evitar el cebado de múltiples sitios .