Cómo utilizar ADN recombinante para modificar genética

ADN recombinante (ADNr ) se refiere a la mezcla de uno o más diferentes hebras de ADN para producir un uno nuevo y completamente sintético. Una vez que el ADN recombinante ha sido insertado en una célula , la proteína de ingeniería se expresa entonces por la célula modificada. El proceso de modificación genética utilizando ADNr se conoce simplemente como gen o de recombinación (o de recombinación ) clonación. Este artículo es una breve descripción de los pasos involucrados en la técnica científica sofisticada de la modificación genética utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para construir rDNA.Things que necesitará
reactivos de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa ( tampones, enzimas , ADN molde , cebadores ) y termocicladores
Pipetas
tubos de PCR o placas
nucleicos mancha ácido (por ejemplo , bromuro de etidio , GelStar ) ADN equipos gel de electroforesis ( agarosa , tanques, corriendo buffers ) y mesa de luz UV
reactivos de ligación (por ejemplo , ADN ligasa T4 y reacción buffers , bloque de calor ) guía empresas Mostrar Más instrucciones Matemáticas 1

Amplify y purificar el tramo de ADN de interés : Utilice un protocolo de amplificación que tiene ya ha sido evaluado y optimizado para los reactivos de la PCR disponibles y específicas para el laboratorio. Preparar los reactivos de PCR como cebadores y si fosforilan estos si la ligadura de extremos romos es el método de clonación de elección . Para la PCR , generalmente de 20 a 25 ciclos de amplificación con la hibridación de un minuto a 50 grados Celsius son suficientes para producir productos completos . Tome 5 a 10 microlitros del producto de PCR y ejecutarlo a cabo en un gel de agarosa para visualizar y confirmar el tamaño del ADN . Recuperar y purificar los productos de PCR por las técnicas básicas de la extracción con fenol - cloroformo y precipitación con etanol
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enzimáticamente digerido y repurify los fragmentos de ADN : . El usuario ya debe saber qué sitios de restricción de enzimas están presentes dentro de la amplificado de ADN antes de comenzar un trabajo, y estos sitios serán utilizados en la creación de una digestión de ' introducir ' los sitios desnudos a los fragmentos . Utilice aproximadamente la mitad del volumen total amplificado para esto y después de la digestión , los fragmentos repurify por gel y extracción con fenol- cloroformo u otros métodos
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ligación de ADN y transfección celular : . Llevar a cabo una ADN experimento de ligación para colocar el fragmento de restricción dentro de un vector que se puede transfectar en una célula bacteriana. Las células se transcribir el nuevo gen recombinante y producir grandes cantidades de la misma. Crece estas bacterias y llevar a cabo experimentos de subclonación para permitir la selección de los transformantes potenciales
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Analizar los subclones para confirmar el gen modificado : . Después de mini , vectores midi- o maxiprepping el plásmido ( expresión ) , repita el proceso de la digestión con enzimas de restricción y visualización en gel, y secuenciar el fragmento amplificado para verificar que no hay mutaciones están presentes .