Los protocolos para ELISA

Un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas ( ELISA ) es un ensayo inmunológico sensible para detectar la presencia de antígenos en muestras biológicas . El ELISA utiliza anticuerpos específicos unidos a una enzima que es detectable mediante el uso de la absorción pasiva de la luz . Hay dos tipos comunes de ELISA : el ELISA directo y Sandwich ELISA . Principios básicos de un ELISA

un ELISA utiliza antígenos que son adsorbidos a los pocillos de placas de microtitulación de plástico , que luego se bloquearon usando un agente para cubrir cualquier superficie abierta a la izquierda en el pozo . El probador añade un anticuerpo primario a adherirse específicamente al antígeno y luego añade un anticuerpo secundario , combinado a una enzima reactiva , para unirse al anticuerpo primario . El probador a continuación, añade un sustrato que cambia de color para visualizar la concentración del antígeno . El color de los aumentos de sustrato junto con la concentración del antígeno.

Reactivos para ELISA

protocolos descritos en " Methods in Molecular Biology " requieren los siguientes reactivos para la cualquier tipo de ELISA : tampón de revestimiento de bicarbonato; PBS que contiene albúmina de suero bovina y Tween 20; tampón de fosfato; tampón de citrato; la solución de parada; Solución de lavado de PBS y peróxido de hidrógeno . Los protocolos describen además composiciones y porcentajes específicos para cada reactivo .
Directo de ELISA

Añadir tampón de carbonato a cada pocillo de una placa de microtitulación seguido de antígeno diluido en un tampón de revestimiento de bicarbonato . Incubar a temperatura ambiente durante dos horas o durante la noche . Lavar la placa y dejar secar a temperatura ambiente. Añadir rábano peroxidasa conjugado a cada pocillo , se diluye a la concentración apropiada y dejar incubar a temperatura ambiente durante dos horas adicionales. Añadir tampón de bloqueo y lavar cada pocillo con solución de lavado . Añadir tampón de citrato a cada pocillo y permitir el desarrollo del color . Después de 10 minutos, interrumpir la reacción con tampón de parada. Medir la absorbancia con un espectrofotómetro .
Sandwich ELISA

Basado en el trabajo de Munro y Lasley ( 1988 ) , el sándwich de ELISA utiliza un ligando peroxidasa de rábano, antisuero y comercial estándares en una placa de microtitulación de 96 pocillos . Los pocillos de la placa están recubiertas con antisuero diluido en tampón de revestimiento de bicarbonato . Sellar placas cuidado e incubar durante 12 horas a 4 grados Celsius. Diluir el conjugado de enzima en tampón de fosfato . Retire el exceso de anticuerpo con solución de lavado y dejar secar a temperatura ambiente. Dispensar tampón fosfato en cada pocillo , seguido por la solución de conjugado que contiene estándares o muestras . Cubra las placas durante dos horas. Lavar las placas y dejar secar a temperatura ambiente. Añadir tampón citrato a los pozos y deje que la preparación . Después de 60 minutos, interrumpir la reacción con una solución de parada. Medir la absorbancia con un espectrofotómetro .