¿Cómo de IP, entonces la sonda fosfoproteína

Muchas proteínas y enzimas en el cuerpo tienen su función de modificar a través de la adición o eliminación de un grupo fosfato a partir de un residuo de aminoácido en la proteína . Los niveles de estas fosfoproteínas son transitorios , y pueden ser difíciles de medir en un laboratorio de investigación. Fosfoproteína se puede medir mediante la eliminación de la proteína a partir de un entorno celular utilizando inmunoprecipitación , seguida por la medición de los niveles de fosfoproteína utilizando un anticuerpo generado contra la fosfoproteína a diferencia de la proteína no fosforilada . Instrucciones Matemáticas 1

Lyse sus células calentándolos en un tampón de lisis. Aunque hay varios tipos de tampones de lisis , todos ellos contienen detergentes a romper las membranas celulares , productos químicos para inhibir la alteración de los niveles de fosfoproteína , y la sal y tampones replicar el ambiente interno de la célula para estabilizar conformaciones de las proteínas .
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Incubar el lisado en una solución que contiene un anticuerpo a la proteína diana . Para obtener los resultados más fiables , se incuba en un suero que contiene un exceso de anticuerpo . Esto se puede determinar mediante la ejecución de experimentos de titulación para medir la afinidad de unión del anticuerpo .
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suero Incubar en una solución que contiene un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo utilizado para orientar su proteína . Esto agregar los anticuerpos y su proteína diana en grupos grandes que se pueden quitar fácilmente de la solución.
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precipitar la proteína objetivo haciendo girar el suero se incubaron en una centrífuga . Retirar el líquido y secar el pellet restante para eliminar el exceso de suero.
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Detectar la forma fosforilada de la proteína diana. Tratar de apuntar solamente la fosfoproteína mediante inmunoprecipitación es impreciso . Un método típico es disolver el sedimento immunoprecipittion y llevar a cabo una transferencia de Western , un método en el que la proteína se separa en un gel de SDS-PAGE por el peso molecular , transferido a una membrana de nitrocelulosa y se expone a anticuerpos para medir los niveles de proteína específicos .