Protocolos de transformación BL21

BL21 es una cepa de la bacteria Escherichia coli utiliza comúnmente en la investigación en biología molecular. Esta cepa puede producir altas cantidades de las sintasas de óxido nítrico neuronal de la enzima , que cataliza la producción de óxido nítrico a partir del aminoácido arginina . De acuerdo a las Actas de la Academia Nacional de Ciencias ( PNAS) , es intrigante que un simple organismo procariota , tal como E. coli tiene la capacidad de expresar una enzima de mamífero complejo como nNOS . BL21 es producido por ingeniería genética , y sus protocolos transformaciones ocurren a menudo a través de choque de temperatura o la electroporación , una técnica que altera el campo electromagnético en la solución de células . Protocolo de Transformación Celular

Técnicos colocan las células en hielo durante 10 minutos. Luego , añaden cuatro microlitros de ADN en la solución de células y mezclar bien con una punta de pipeta. Colocan la solución de nuevo en hielo durante 30 minutos, el choque térmico de las células utilizando un 107,6 grados Fahrenheit baño de agua durante 45 segundos y, a continuación, poner de nuevo en hielo durante otros dos minutos. Por último , los técnicos de correr la solución de células en placas de medio LB Kan , e incubar a 98.6 grados Fahrenheit durante 6 horas. Expresión de proteínas es inducida mediante isopropil- beta- D- 1 - tiogalactopiranósido .
BL21 transformación por electroporación Protocolos

Técnicos preparar un medio de cultivo celular sin suero y evaluar la viabilidad previo a la realización de la electroporación, utilizando tinción con azul tripán seguido por observación microscópica. Las muestras se colocan en un aparato llamado un electroporador . Según Martin J. Tymms en " Factor de Transcripción Protocolos ", al incrementarse el voltaje , la viabilidad celular disminuye. Las condiciones de electroporación que reducen la viabilidad por 50 por ciento también son las condiciones en las que la expresión del gen es cercana a la máxima . " La expresión génica " se refiere a la producción de proteínas específicas , de acuerdo con la relación segmentos de ADN .
Inserción de CITS y transformación de células BL21

Este protocolo implica la transformación de la cepa de E. coli BL21 , que crece en medio de caldo Luria en 98.6 grados Fahrenheit. Citrato de portadora ( CITS ) se expresaron en E. coli BL21 la adición de la carbenicilina química a una concentración de 100 mg por ml . Actividad de transporte de citrato en las cepas recombinantes se detectó como halos azules alrededor de las colonias en placas de agar citrato de Simmons . La actividad fosfatasa alcalina se detectó como colonias azules sobre placas de agar Luria caldo que contienen el sustrato cromogénico fosfato de 5 - bromo - 4 - cloro - 3 - indolilo (sal de toluidina; XP ) . A una concentración de 40 mg por ml