Métodos de aislamiento de proteínas

Las proteínas se aislaron a partir de células o tejidos pulverizados. Una vez que la célula se rompe abierto , su contenido o lisado se recogieron para una purificación adicional basada en las propiedades de la proteína , tales como su tamaño, carga y afinidad de unión específica. Aunque existen muchos protocolos técnicos , hay algunos métodos utilizados rutinariamente .
Las proteínas se aíslan de forma rutinaria y fácilmente utilizando técnicas bien establecidas en diferentes contextos biológicos y farmacéuticos .
Diálisis

Este método involucra la filtración de un lisado o proteína solución diluida a través de un semi membrana permeables , de modo que proteínas más grandes que el diámetro de los poros puntuando la superficie de la membrana y sólo retienen los pequeños se extruyen . La diálisis también se puede utilizar para concentrar la solución de proteína; Sin embargo , ya que este método no puede diferenciar de manera eficiente las proteínas , a menudo es seguido por otras técnicas más específicas. Los sistemas automatizados ahora existen que pueden llevar a cabo la diálisis , y varios kits comerciales también proporcionan los reactivos necesarios ( soluciones ) .
Precipitación y solubilización

Las proteínas no hacen disolver (o " solubilizar " ) bien en soluciones de concentraciones elevadas de sal . Esta propiedad de la solubilidad será diferente entre las proteínas y es una buena manera de distinguir entre estrechamente relacionados queridos. De una solución de varias proteínas , cantidades crecientes de sales como el sulfato de amonio se puede utilizar para fraccionar y precipitar las proteínas más grandes primero (en los niveles de sulfato de amonio inferiores) , y por lo tanto también para concentrar muestras muy diluidas. Este es el método más utilizado debido a su simplicidad .
Cromatografía

Esto incluye filtración en gel , intercambio iónico , afinidad y cromatografía líquida de alta presión ( HPLC ) . En todos los casos , se permite que el lisado a fluir a través de una columna que contiene perlas porosas de diferentes , pero características específicas . Cromatografía de filtración en gel para separar las proteínas pequeñas de las grandes, utiliza cuentas hechas de materiales tales como dextrano , poliacrilamida o agarosa . Cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas de los granos de carga utilizando netos que tienen grupos carboxilato sobre ellos. Las proteínas que se pegan a las perlas se retienen , mientras que los que se unen débilmente o nada en absoluto de flujo recto a través y se recogen por el otro extremo de la columna. También es posible recuperar la proteína que se une . Este enfoque se utiliza en cromatografía de afinidad , que aprovecha la afinidad de una proteína para ligandos químicos específicos . La proteína unida se elimina mediante lavado de la columna por inundación de las perlas con una solución para disminuir la unión . HPLC es una resolución más alta , más rápida y la versión muy mejorada de la cromatografía .
Ultra - centrifugación

Soluciones de proteínas de diversas masas o densidades pueden ser separados basados ​​en la tiempo que tarda en hundirse o sedimentar en el fondo de un tubo durante la centrifugación. Las partículas más pesadas y /o más densas se sedimenten en primer lugar, mientras que los más ligeros o menos densos quedarán disueltos . La separación de proteínas se lleva a cabo en una solución que contiene un capas de concentración creciente o decreciente de material , tal como sacarosa o algunos otros medios de comunicación, como Percoll . Ultracentrifugación en este " gradiente de concentración " permite la separación de proteínas grandes de los más pequeños. Tanto el sedimento y el sobrenadante (que contiene las proteínas más pequeñas ) pueden ser recogidos para su posterior purificación o análisis.
Conclusión

Los buenos métodos de aislamiento producirán grandes cantidades y de alta purificación proteínas , y en cada caso , los requisitos experimentales subsiguientes deben tenerse en cuenta al seleccionar el método más adecuado de usar. Buenos recursos para más detalle y protocolos precisos son Clive Dennison 'A Guía Para Aislamiento de Proteínas " ( Kluwer , 2003) y Hafiz Ahmed de ' Principios y reacciones de extracción de proteínas , purificación y caracterización ( CRC Press, 2005 ) . Sin embargo la mayoría de los protocolos y laboratorios Profesional desarrollados comercialmente kits que constan de pasos técnicos simples y eficaces , pero lo más importante , de alta pureza , para el aislamiento de varias clases de proteínas .